截至目前,國(guó)家藥監(jiān)局新型冠狀病毒應(yīng)急醫(yī)療器械審批批準(zhǔn)總計(jì)29款,其中,核酸檢測(cè)類(lèi)有18款,血清抗體類(lèi)有11款,核酸檢測(cè)和抗體/抗原檢測(cè)是確認(rèn)新冠病毒的重要手段,也是患者確診的重要流程之一,但你知道他們的檢測(cè)原理是什么?樣本類(lèi)型有哪些?檢驗(yàn)又是一個(gè)怎么樣的流程以及存在哪些問(wèn)題 ?今天,小編來(lái)給大家科普一下~~
新型冠狀病毒核酸檢測(cè)
核酸檢測(cè)具有早期診斷、靈敏度和特異性高等特點(diǎn),是確診新冠肺炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”,目前使用最廣泛的是實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)。一般檢測(cè)位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個(gè)靶標(biāo),同一份標(biāo)本需滿足雙靶標(biāo)陽(yáng)性或重復(fù)檢測(cè)為單靶標(biāo)陽(yáng)性或兩種標(biāo)本同時(shí)滿足單靶標(biāo)才能確認(rèn)SARS-CoV-2病毒核酸陽(yáng)性。
1、核酸檢測(cè)試劑盒原理?
以病毒獨(dú)特的基因序列為檢測(cè)靶標(biāo),通過(guò)PCR擴(kuò)增,使我們選擇的這段靶標(biāo)DNA序列指數(shù)級(jí)增加,每一個(gè)擴(kuò)增出來(lái)的DNA序列,都可與我們預(yù)先加入的一段熒光標(biāo)記探針結(jié)合,產(chǎn)生熒光信號(hào),擴(kuò)增出來(lái)的靶基因越多,累積的熒光信號(hào)就越強(qiáng)。而沒(méi)有病毒的樣本中,由于沒(méi)有靶基因擴(kuò)增,因此就檢測(cè)不到熒光信號(hào)增強(qiáng)。所以,核酸檢測(cè)其實(shí)就是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的累積來(lái)確定樣本中是否有病毒核酸。
2、核酸檢測(cè)樣本類(lèi)型有哪些?
一般為鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。
3、五個(gè)步驟檢測(cè)新型冠狀病毒
檢測(cè)程序需要經(jīng)過(guò)五個(gè)步驟,取樣、留樣、保存、核酸提取、上機(jī)檢測(cè),這需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)實(shí)驗(yàn)才能完成。
1. 用咽拭子擦拭咽后壁及雙側(cè)咽扁桃體處各5-10次,且不斷旋轉(zhuǎn)拭子;
2. 需要醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行留樣,將拭子頭浸入細(xì)胞保存液中,折斷尾部后立即旋緊管蓋;
3. 保存,將樣本管放入密封袋中及時(shí)送檢,而送檢過(guò)程中需要嚴(yán)格的運(yùn)輸環(huán)境,2-8攝氏度保存。
4. 操作核酸提取,將滅活病毒后的樣本進(jìn)行核酸提取,用于后續(xù)檢測(cè),可以采用自動(dòng)化的設(shè)備,如核酸提取儀等。
5. 熒光PCR核酸檢測(cè),也就是上機(jī)器檢測(cè),將提取物進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)曾反應(yīng),需要70—80分鐘。
4、核酸檢測(cè)存在哪些問(wèn)題?
■ 假陰性,由于采樣不當(dāng)、標(biāo)本保存不當(dāng)、采用不同類(lèi)型的標(biāo)本以及使用不同廠家試劑都可能造成核酸檢測(cè)結(jié)果“假陰性”而出現(xiàn)漏診;
■ 對(duì)檢測(cè)設(shè)備或平臺(tái)要求較高,高靈敏度的RT-PCR儀價(jià)格不菲,對(duì)實(shí)驗(yàn)室的潔凈度和操作人員要求也較高;
■ 核酸檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng),完成一個(gè)RT-PCR的檢測(cè)通常需要4-6個(gè)小時(shí),然而考慮到樣本運(yùn)輸、大量樣本積壓的情況,通常最快24小時(shí)才可以報(bào)告結(jié)果。
因此當(dāng)核酸檢測(cè)陰性時(shí),將IgM和IgG抗體檢測(cè)增加進(jìn)去,可以彌補(bǔ)核酸檢測(cè)容易造成漏診的缺點(diǎn)。
新型冠狀病毒血清抗體檢測(cè)
新型冠狀病毒肺炎發(fā)病7天后,血清特異性抗體逐漸產(chǎn)生,首先出現(xiàn)的是免疫球蛋白IgM抗體,然后出現(xiàn)IgG抗體。因此,IgM抗體增高提示近期急性感染,IgG抗體增高提示既往感染。
血清學(xué)檢測(cè)最大的優(yōu)勢(shì)在于方便快捷,檢測(cè)時(shí)間較短,能夠有效突破現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)對(duì)人員、場(chǎng)所的限制,縮短檢測(cè)用時(shí),被寫(xiě)進(jìn)了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》。如果疑似病例血清特異性IgM和IgG抗體陽(yáng)性,IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期有4倍及以上升高,則可以診斷其感染了新冠病毒。
1、血清抗體檢測(cè)試劑盒原理?
采用膠體金免疫技術(shù),在結(jié)合墊處噴涂膠體金標(biāo)記的重組新型冠狀病毒抗原和質(zhì)控抗體金標(biāo)記物;NC膜上包被兩條檢測(cè)線(G線和M線)和一條質(zhì)控線(C線)。M線包被有鼠抗人IgM單抗,G線包被有鼠抗抗人IgG單抗,C線包被有質(zhì)控抗體。樣本加到加樣孔中,該樣本在層析作用下將沿檢測(cè)卡向前移動(dòng),如果樣本中含有新冠狀病毒IgM抗體,則該抗體與膠體金標(biāo)記病毒抗原結(jié)合,形成夾心復(fù)合物,將會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。如果樣本中含有新型冠狀病毒IgG抗體,則該抗體會(huì)與膠體金標(biāo)記新型冠狀病毒抗原結(jié)合,形成夾心復(fù)合物,將會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。該檢測(cè)卡還包含一條質(zhì)控線(C線),用于判斷層析過(guò)程是否順利。
2、血清抗體檢測(cè)樣本類(lèi)型有哪些?
一般為血液,包括血清、血漿和全血。
3、三個(gè)步驟檢測(cè)新型冠狀病毒
1. 打開(kāi)檢測(cè)卡鋁箔袋,將檢測(cè)卡取出并水平放置于桌面上;
2. 用移液器吸取血清/血漿/全血樣本加到加樣處,再用同樣的方法吸取緩沖液滴加至檢測(cè)卡加樣孔中。
3. 等待15分鐘,判讀結(jié)果。
4、血清抗體檢測(cè)存在哪些問(wèn)題?
■ 假陽(yáng)性,個(gè)別患者血液中含有類(lèi)風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、自身抗體,以及藥物和腫瘤細(xì)胞等,易造成試驗(yàn)的交叉反應(yīng),故偶現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果;
■ 假陰性,由于血清抗體檢測(cè)方法存在一定的窗口期以及檢測(cè)試劑盒的靈敏度不同會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
因此血清抗體檢測(cè)僅用作對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測(cè),不能單獨(dú)作為診斷指標(biāo)用于篩查。聯(lián)合使用血清抗體檢測(cè)與核酸檢測(cè),有助于提高疾病的檢出率,盡可能地找出確診患者,更有利于疫情的控制。
核酸與IgG、IgM抗體聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果解讀
新型冠狀病毒抗原檢測(cè)
新型冠狀病毒抗原檢測(cè)可直接檢測(cè)出人體樣本中是否含有新型冠狀病毒,診斷快速、準(zhǔn)確、對(duì)設(shè)備和人員要求低,采用雙抗夾心法,使用兩種抗原特異性抗體去識(shí)別和結(jié)合一個(gè)靶點(diǎn)抗原的不同表位,則可以大大降低交叉反應(yīng)的幾率,從而有效提高其特異性。
1、抗原檢測(cè)試劑盒原理?
新型冠狀病毒的N蛋白、E蛋白和S蛋白等抗原,可作為免疫原,在病毒感染人體后,刺激漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。依據(jù)雙抗夾心ELISA原理,樣本滴加在樣本墊上,通過(guò)液相層析依次通過(guò)結(jié)合墊,NC膜上的檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)。結(jié)合墊內(nèi)含有標(biāo)記的抗原特異性抗體,可以與樣本中的抗原(病毒蛋白)發(fā)生結(jié)合,當(dāng)液流到達(dá)檢測(cè)線(T線)時(shí),固定在這條線上的第二種抗原特異性抗體再次與抗原結(jié)合,將會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。質(zhì)控線(C線)包被IgG抗體,可以結(jié)合樣本墊中抗體,用于判斷層析過(guò)程是否順利。
2、抗原檢測(cè)樣本類(lèi)型有哪些?
一般為感染部位的樣本,例如口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、血清、血漿等。
3、四個(gè)步驟檢測(cè)新型冠狀病毒
1. 將標(biāo)本處理液滴至標(biāo)本處理管中;
2. 將取樣拭子攪拌并擠壓管壁,是標(biāo)本充分洗脫至處理液中;
3. 取出檢測(cè)卡,向圓孔中加樣;
4. 等待15分鐘,判讀結(jié)果。
4、抗原檢測(cè)存在哪些問(wèn)題?
■ 假陰性,抗原檢測(cè)需要更高的敏感性,由于新型冠狀病毒主要侵犯肺泡等下呼吸道,所以從鼻咽、口咽等上呼吸道取樣,不一定能取到病原體,或者取樣中所含病毒數(shù)量較少,這些因素都可造成漏檢;
■ 制備工藝繁瑣耗時(shí),研發(fā)抗原試劑盒需要先將重組抗原制備出來(lái),再打到小鼠體內(nèi)制備單克隆抗體,約需要兩三個(gè)月,如果制備出的抗體性能不好還需要重新制備,又需要兩三個(gè)月。
因此抗原檢測(cè)方法尚未成熟,目前沒(méi)有抗原檢測(cè)試劑盒被國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)注冊(cè)。
聯(lián)合檢測(cè)
新型冠狀病毒核酸/抗體/抗原檢測(cè)各有側(cè)重,不能相互替代,多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用,互為補(bǔ)充,將分子生物和免疫水平檢測(cè)相結(jié)合,發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì),提高靈敏性與特異性,可有效縮短檢測(cè)窗口期,提高陽(yáng)性檢出率,為各種可能的風(fēng)險(xiǎn)人群提供雙重保障。
參考文獻(xiàn):Zhengtu Li,Yongxiang Yi et al. Development and clinical application of a rapid IgM‐IgG combined antibody test for SARS‐CoV‐2 infection diagnosis. J Med Virol.2020;1-7
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